單外泌體表征分析

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)—Leprechaun能夠針對性的捕獲外泌體，檢測其粒徑大小并結(jié)合熒光分析，確認(rèn)外泌體是否含有所有標(biāo)志物蛋白，從而獲得外泌體的相關(guān)顆粒濃度及表型信息。

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)—Leprechaun可以測量低至35 nm的囊泡。從外泌體到外泌顆粒，Leprechaun可以讓您獲得這些小顆粒的粒徑大小，顆粒數(shù)量和表信息。對于特殊樣品，您可以使用自己的檢測抗體定制檢測方法，或者使用Flex試劑盒定制您用來捕獲外泌體的特異性識別抗體。無論您的標(biāo)記物在內(nèi)部的還是外部的， Leprechaun只需幾微升無需純化的樣品，就可以給您提供多達四種蛋白質(zhì)的共定位信息。

慢病毒表征分析

在生產(chǎn)過程的每個階段，都可以對每個慢病毒顆粒進行完整的生物物理鑒定。使用我們的抗體或您的抗體捕獲低至1x107顆粒/毫升的病毒樣品，根據(jù)病毒的粒徑大小識別出單個病毒或者團聚體。使用熒光抗體標(biāo)記病毒衣殼蛋白，使用RNA探針標(biāo)記病毒核酸，確認(rèn)病毒的完整性和空實心比。Lepre-chaun可以分析任何慢病毒，無論其結(jié)構(gòu)如何變化。

Leprechaun全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)是一款無需純化的、全自動的可對單個外泌體進行表征分析的全新設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全面的外泌體表征信息，包括外泌體粒徑大小、計數(shù)、分布、攜帶蛋白表達、生物標(biāo)志物（CD9，CD81，CD63等）共定位等。操作簡單，結(jié)果可靠。一經(jīng)推出，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，短短兩年時間在全球已有50多個實驗室采用該技術(shù)，發(fā)表重要文獻近百篇。

Leprechaun全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)基本原理是一種基于特異性免疫捕獲技術(shù)，允許研究者直接分析特定群體的外泌體或外囊泡。通過配套的試劑盒，客戶一次性能夠分析多達9個不同的樣本，大大節(jié)省了時間和經(jīng)濟成本。兼容各種生物樣本，除了純化的外泌體之外，對于血液、尿液、惡性腫瘤、腹水中的外泌體也可直接檢測分析，大大拓展了研究范圍。

Unchained收購?fù)饷隗w公司NanoView

2022 年 5 月6日，Unchained Labs （Unchained）是一家致力于為生物制劑和基因治療研究人員提供合適工具的生命科學(xué)公司，該公司當(dāng)日宣布收購了外泌體公司NanoView Biosciences（NanoView）。NanoView 的 ExoView 技術(shù)在表征外泌體方面處于地位，他們最近推出的 LentiView 平臺是研究慢病毒的基因治療研究人員的游戲規(guī)則改變者。

外泌體是細(xì)胞釋放的信使粒子。它們是有關(guān)疾病的已知信息來源，但也是基因治療有效載荷的高潛力載體。ExoView 使用抗體芯片通過其表面蛋白捕獲外泌體，使用高分辨率干涉儀確認(rèn)其大小，并識別多達 5 種具有 4 色熒光的額外表面蛋白。研究人員可以尋找感興趣的外泌體，或者獲得他們正在開發(fā)的基因療法的真實滴度——即使是在粗糙、雜亂的樣本中也是如此。慢病毒在修改基因組方面非常出色，這就是為什么基因治療開發(fā)如此之多的原因。問題是它們巨大、難以制造且高度復(fù)雜——由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和帶有有效載荷的衣殼組成。如今，對慢病毒進行表征非常具有挑戰(zhàn)性，需要研究人員進行純化，然后使用 ELISA 或 PCR 等破壞性分析來找出難題的一部分。

LentiView 改變了游戲規(guī)則，讓研究人員可以直接看到原始樣品中的每個成分。LentiView 結(jié)合了微芯片上的抗體捕獲、熒光和干涉測量技術(shù)，可以準(zhǔn)確地告訴研究人員他們想知道的關(guān)于慢病毒的信息——有多少、大、純、滿或空，以及是否有靶向蛋白質(zhì)。

“NanoView 一直致力于幫助外泌體研究人員表征這些復(fù)雜的顆粒，"NanoView Biosciences 執(zhí)行官 Jerry Williamson 說。“我們剛剛開始進行病毒載體表征，沒有比 Unchained Labs 更好的公司來幫助我們將 LentiView 交到基因治療研究人員手中。"

Unchained Labs 的創(chuàng)始人兼執(zhí)行官 Tim Harkness 說：“基因療法的發(fā)展正在爆炸式增長，研究人員迫切需要更好的工具。" “我們的使命是為他們提供更好的方法來表征這些的復(fù)雜載體，我很高興將 NanoView 的基因治療解決方案添加到我們的產(chǎn)品組合中，并讓他們的團隊加入我們的事業(yè)。"

Unchained Labs公司所開發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)是一款無需純化的、全自動的可對單個外泌體進行表征分析的全新設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全面的外泌體表征信息，包括外泌體粒徑大小、計數(shù)、分布、攜帶蛋白表達、生物標(biāo)志物（CD9，CD81，CD63等）共定位等。

應(yīng)用方向及主要特征

外泌體粒徑分析

能夠?qū)?gt;50 nm的外泌體進行全方面的表征，無論是粒徑尺寸、粒徑分布還是外泌體的亞型均可在一次測試中得到。并且所用來測試的樣本無需進行純化，避免因純化帶來的樣本偏差。

分析不同大小和不同尺度的外泌體亞群，在CD171過表達系統(tǒng)中，100 nm以上的外泌體僅表達了CD171。

量化外泌體亞群

通過抗體捕獲的模式，能夠量化含有不同標(biāo)記物的外泌體亞群，并對不同種群的外泌體進行特異性計數(shù)和分析。整個過程無需純化，并且線性范圍可跨越3個數(shù)量級。

TSPAN8陽性細(xì)胞外囊泡的稀釋曲線。使用1:3比例的梯度稀釋。用R2 = 0.9986計算與TSPAN8熒光數(shù)據(jù)的線性擬合。

檢測外囊泡中的裝載物

MISEV建議在表征外泌體和外囊泡時，應(yīng)當(dāng)同時測量表面和載體蛋白。使用ExoView芯片可穿透外泌體，探測膜內(nèi)蛋白和載體。并且單次可定量3種表面、管腔蛋白。

檢測細(xì)胞外泌體內(nèi)的Syntenin

WT細(xì)胞在未穿膜的條件下幾乎觀測不到Syntenin的信號。進行穿膜處理后可以觀測到Syntenin信號，而KO之后信號消失

生物標(biāo)志物共定位

能夠在單個外泌體樣本上檢測多達4種標(biāo)記物，并同時提供外泌體的其它表征數(shù)據(jù)諸如計數(shù)、顆粒尺寸統(tǒng)計等。

無需純化

只測量含有靶標(biāo)抗原的特定細(xì)胞外泌體群體。僅需35 μL的稀釋樣品，即可直接獲得外泌體的表型、粒徑和計數(shù)信息。并且無需擔(dān)心污染物對測試的影響。

無論純化與否，Exoview均可進行分析

ExoView™ Kit 配置清單:

應(yīng)用案例：

對不同體液中小RNA測序以篩選最佳的胞外RNA提取方法

exRNA profile會受到不同來源（細(xì)胞/組織），不同狀態(tài)（年齡/健康程度/器官狀態(tài)）的影響，且由包括外泌體在內(nèi)的不同的載體運輸，加上不同的提取方法和檢測技術(shù)，均會影響exRNA profile的測定結(jié)果。現(xiàn)今的小RNA測序方法已經(jīng)可以準(zhǔn)確地表征exRNA profile，因此合適的exRNA提取方法便至關(guān)重要。Srinivasan[1]等通過使用多種exRNA分離方法分離不同位點獲得的5種體液中的外泌體，分析結(jié)果后總結(jié)出了不同體液的適合分離方法。

其中，研究人員使用單個外泌體表型分析技術(shù)檢測了來源于人血漿的外泌體的蛋白marker表達，判斷出血漿外泌體根據(jù)蛋白marker主要分為CD63-/CD81+/CD9+和CD63+/CD81+/CD9+兩種。

人血漿外泌體蛋白表達分析

參考文獻：Srinivasan, S., Yeri, A., Cheah, P. S., Chung, A., Danielson, K., De Hoff, P., ... & Laurent, L. C. (2019). Small RNA sequencing across diverse biofluids identifies optimal methods for exRNA isolation. Cell, 177(2), 446-462.

脊髓損傷導(dǎo)致血清神經(jīng)炎癥相關(guān)納米顆粒中miRNA與CD81+外泌體水平的改變

脊髓損傷（SCI）會對機體產(chǎn)生系統(tǒng)性影響，導(dǎo)致呼吸、免疫、消化等功能異常，以及相關(guān)腦區(qū)產(chǎn)生神經(jīng)炎癥和退行性病變。有研究表明，SCI的病理與系統(tǒng)性影響可能與血液來源的因子如外泌體的運輸有關(guān)；而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，外泌體可能參與了miRNA等炎性因子運輸導(dǎo)致炎癥擴散。Khan等使用外泌體表型分析的多種技術(shù)詳細(xì)表征了SCI建模的小鼠血漿外泌體，發(fā)現(xiàn)損傷后外泌體數(shù)量、蛋白marker和內(nèi)容物均有明顯的變化，將SCI小鼠的外泌體注射入腦室還可誘發(fā)產(chǎn)生炎癥。

研究人員測了SCI血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強度和共定位（圖1A）。外泌體在CD81和CD9區(qū)域產(chǎn)生特異性結(jié)合而被捕獲，而沒有CD63捕獲。根據(jù)干涉成像獲得外泌體尺寸分布，其中在50nm最多（圖1B&C）。熒光成像則檢測到了大量干涉成像檢測不出的尺寸小于50nm的外泌體（圖1D&E），CD81和CD9在大量外泌體上表型出熒光共定位，而CD63熒光則未被檢測到，這與圖1C結(jié)果一致（圖1F-H）。相比之下，NTA與流式分析無法檢測到尺寸小于50nm的外泌體。

圖1檢測血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強度和共定位

研究人員進一步比較了SCI組和對照組的血漿外泌體變化，結(jié)果表明，在損傷后1d的時間點，CD81外泌體數(shù)量相對對照組更高，與Western Blot的結(jié)果一致；而CD9外泌體數(shù)量則沒有統(tǒng)計學(xué)差異，與流式分析的結(jié)果一致（圖2A&B）。基于圖2H的CD81與CD9有大量的熒光共定位，檢測CD9外泌體的CD81熒光強度，由1d的熒光強度中位數(shù)差異可知，

圖2檢測血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強度和共定位

參考文獻： Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2020). Spinal cord injury alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and immunity.

Cells：CD44糖蛋白在胃癌發(fā)生中的作用
CD44是一種跨膜糖蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間與細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用，主要配體為透明質(zhì)酸（HA）。研究表明，CD44與腫瘤的生長相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞中高表達，且CD44與HA的結(jié)合親和力高，因此納米載體常用HA做表面修飾以作為腫瘤細(xì)胞的靶向藥物載體。外泌體是天然的靶向信息傳遞載體，有研究在外泌體中檢測到CD44。H?rk?nen等[1]使用胃癌細(xì)胞MKN74研究了CD44表達對外泌體分泌，HA合成與腫瘤細(xì)胞生長的影響。結(jié)果表明，CD44促進了細(xì)胞表面和細(xì)胞間的HA形成，調(diào)控腫瘤微環(huán)境；CD44可改變外泌體的物理性質(zhì)以及靶向性質(zhì)。

其中，研究人員使用Exoview檢測了MKN74細(xì)胞的未經(jīng)純化的培養(yǎng)基及分離純化后的外泌體中的含CD44以及其他標(biāo)記物的含量。結(jié)果表明，相對于對照組，MOCK（CD44敲除）細(xì)胞組在未經(jīng)純化的培養(yǎng)基及分離純化后的分泌外泌體的數(shù)量顯著降低。以上結(jié)果表示ExoView可以直接對復(fù)雜環(huán)境的培養(yǎng)基進行檢測，無需分離純化步驟，且檢測結(jié)果具有*特異性。

檢測表達不同蛋白標(biāo)記物的外泌體數(shù)量

參考文獻： H?rk?nen, K., Oikari, S., Kyykallio, H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

Cancer Cell Int：外泌體與miRNA調(diào)節(jié)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的干細(xì)胞性

腦瘤中部分細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，能夠自我更新并分化為不同細(xì)胞系。其中，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的病人有25%經(jīng)過傳統(tǒng)療法后5年內(nèi)復(fù)發(fā)并轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡，存活的病人也受到治療副作用和并發(fā)癥影響，因此需要一種安全有效的治療方法。腫瘤細(xì)胞的外泌體含有miRNA，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程并與抗藥性相關(guān)。有研究表明腫瘤干細(xì)胞的外泌體運載了腫瘤細(xì)胞*的miRNA，能夠產(chǎn)生有利于腫瘤發(fā)展的微環(huán)境。Choi等研究了成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的外泌體及運載的miRNA及其在腫瘤康復(fù)中的潛在作用。其中，miR-135b和miR-135a在腫瘤干細(xì)胞中高表達，抑制兩者會導(dǎo)致具有腫瘤抑制作用的Angiomotin?like 2（AMOTL2）表達上升，使腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞特性下降。

其中，研究人員通過熒光成像檢測腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的外泌體標(biāo)記物，在兩種細(xì)胞的外泌體上均檢測到了Alix和Syntenin兩種內(nèi)蛋白，并且可以確定兩種內(nèi)蛋白與CD63/CD9外泌體標(biāo)記物共定位。

檢測外泌體上的Alix（a）與Syntenin（b）蛋白

參考文獻： Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J. H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

外泌體計數(shù)、粒徑、蛋白表達、蛋白共定位一次完成

北京佰司特科技有限責(zé)任公司

類器官串聯(lián)芯片培養(yǎng)系統(tǒng)—HUMIMIC；類器官灌流式培養(yǎng)和代謝監(jiān)測系統(tǒng)—IMOLA；

蛋白穩(wěn)定性分析儀—PSA-16；單分子穩(wěn)定性分析儀（磁鑷力譜測量儀）—HiMT；單分子質(zhì)量光度計—TwoMP；超高速視頻級原子力顯微鏡—HS-AFM；微流控擴散測量儀—Fluidity One-M；

微納加工點印儀—NLP2000/DPN5000；臺式原子力顯微鏡—ACST-AFM；全自動半導(dǎo)體式細(xì)胞計數(shù)儀—SOL COUNT；農(nóng)藥殘留定量檢測儀—BST-100；